Fluorescenčný filter je nevyhnutnou súčasťou fluorescenčného mikroskopu.Typický systém má tri základné filtre: budiaci filter, emisný filter a dichroické zrkadlo.Bežne sú balené v kocke tak, že sa skupina vloží spolu do mikroskopu.
Ako funguje fluorescenčný filter?
Filter excitácie
Excitačné filtre prepúšťajú svetlo určitej vlnovej dĺžky a blokujú ostatné vlnové dĺžky.Môžu byť použité na vytváranie rôznych farieb vyladením filtra tak, aby prepúšťal iba jednu farbu.Budiace filtre sa dodávajú v dvoch hlavných typoch — dlhopriepustné filtre a pásmové priepusty.Budič je zvyčajne pásmový filter, ktorý prepúšťa iba vlnové dĺžky absorbované fluorofórom, čím sa minimalizuje excitácia iných zdrojov fluorescencie a blokuje excitačné svetlo vo fluorescenčnom emisnom pásme.Ako ukazuje modrá čiara na obrázku, BP je 460-495, čo znamená, že môže prejsť iba fluorescenciou 460-495nm.
Je umiestnený v dráhe osvetlenia fluorescenčného mikroskopu a filtruje všetky vlnové dĺžky svetelného zdroja okrem excitačného rozsahu fluorofóru.Minimálna priepustnosť filtra určuje jas a brilantnosť obrázkov.Pre akýkoľvek budiaci filter sa odporúča minimálne 40 % prevod, takže prevod je ideálne > 85 %.Šírka pásma excitačného filtra by mala byť úplne v rozsahu excitácie fluorofóru tak, aby stredná vlnová dĺžka (CWL) filtra bola čo najbližšie k maximálnej excitačnej vlnovej dĺžke fluorofóru.Optická hustota (OD) excitačného filtra určuje tmavosť obrázka na pozadí;OD je miera toho, ako dobre filter blokuje vlnové dĺžky mimo prenosového rozsahu alebo šírky pásma.Odporúča sa minimálna OD 3,0, ale ideálna je OD 6,0 alebo väčšia.
Emisný filter
Emisné filtre slúžia na to, aby umožnili želanej fluorescencii vzorky dosiahnuť detektor.Blokujú kratšie vlnové dĺžky a majú vysoký prenos pre dlhšie vlnové dĺžky.Typ filtra je tiež spojený s číslom, napr. BA510IF na obrázku (interferenčný bariérový filter), toto označenie sa vzťahuje na vlnovú dĺžku pri 50 % jeho maximálnej priepustnosti.
Rovnaké odporúčania pre excitačné filtre platia aj pre emisné filtre: minimálny prenos, šírka pásma, OD a CWL.Emisný filter s ideálnou kombináciou CWL, minimálnym prenosom a OD poskytuje najjasnejší možný obraz s najhlbším možným blokovaním a zaisťuje detekciu najslabších emisných signálov.
Dichroické zrkadlo
Dichroické zrkadlo je umiestnené medzi excitačným filtrom a emisným filtrom pod uhlom 45° a odráža excitačný signál smerom k fluorofóru, pričom vysiela emisný signál smerom k detektoru.Ideálne dichroické filtre a rozdeľovače lúčov majú ostré prechody medzi maximálnym odrazom a maximálnym priepustnosťou, s >95% odrazom pre šírku pásma excitačného filtra a s priepustnosťou >90% pre šírku pásma emisného filtra.Vyberte filter s ohľadom na priesečník vlnovej dĺžky (λ) fluorofóru, aby ste minimalizovali rozptýlené svetlo a maximalizovali pomer signálu k šumu fluorescenčného obrazu.
Dichroické zrkadlo na tomto obrázku je DM505, tak pomenované, pretože 505 nanometrov je vlnová dĺžka pri 50 % maximálnej priepustnosti pre toto zrkadlo.Krivka priepustnosti pre toto zrkadlo ukazuje vysokú priepustnosť nad 505 nm, prudký pokles priepustnosti vľavo od 505 nanometrov a maximálnu odrazivosť vľavo od 505 nanometrov, ale stále môže mať určitý priepustnosť pod 505 nm.
Aký je rozdiel medzi dlhými a pásmovými filtrami?
Fluorescenčné filtre možno rozdeliť do dvoch typov: dlhý priepust (LP) a pásmový priepust (BP).
Dlhopriepustné filtre prepúšťajú dlhé vlnové dĺžky a blokujú tie kratšie.Hraničná vlnová dĺžka je hodnota pri 50 % špičkového prenosu a všetky vlnové dĺžky nad medzou sú prenášané dlhými priepustmi.Často sa používajú v dichroických zrkadlách a emisných filtroch.Dlhopriepustné filtre by sa mali používať, keď aplikácia vyžaduje maximálny zber emisií a keď spektrálna diskriminácia nie je žiaduca alebo potrebná, čo je vo všeobecnosti prípad sond, ktoré generujú jeden emitujúci druh vo vzorkách s relatívne nízkou úrovňou autofluorescencie pozadia.
Pásmové filtre prenášajú iba určité pásmo vlnovej dĺžky a blokujú ostatné.Znižujú presluchy tým, že umožňujú prenášať len najsilnejšiu časť emisného spektra fluorofórov, znižujú autofluorescenčný šum a tým zlepšujú pomer signálu k šumu vo vzorkách autofluorescencie s vysokým pozadím, ktoré dlhopriepustné filtre nedokážu ponúknuť.
Koľko typov súprav fluorescenčných filtrov môže BestScope dodať?
Niektoré bežné typy filtrov zahŕňajú modré, zelené a ultrafialové filtre.Ako je uvedené v tabuľke.
| Sada filtrov | Filter excitácie | Dichroické zrkadlo | Bariérový filter | Vlnová dĺžka LED lampy | Aplikácia |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Metóda fluorescenčných protilátok ·Acidínová oranž: DNA, RNA · Auramín: tuberkulózny bacil ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | 570 DM | BA575 | 535 nm | ·Rhodamín, TRITC: Fluorescenčná protilátková metóda ·Propidium jodid: DNA · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | · Auto-fluorescenčné pozorovanie ·DAPI: farbenie DNA ·Hoechest 332528, 33342: používa sa na farbenie chromozómov |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | · Katecholamíny · 5-hydroxytryptamín ·Tetracyklín: kostra, zuby |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 · Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Sady filtrov, ktoré sa používajú pri získavaní fluorescencie, sú navrhnuté na základe hlavných vlnových dĺžok používaných vo fluorescenčných aplikáciách, čo je založené na najpoužívanejších fluorofóroch.Z tohto dôvodu sú tiež pomenované podľa fluorofóru, na ktorý sú určené, ako napríklad filtračné kocky DAPI (modrá), FITC (zelená) alebo TRITC (červená).
| Sada filtrov | Filter excitácie | Dichroické zrkadlo | Bariérový filter | Vlnová dĺžka LED lampy |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Auramín | BP470 | 480 DM | BA485 | 450 nm |
| Texas Red | BP540-580 | 595 DM | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Ako si vybrať fluorescenčný filter?
1. Princípom výberu fluorescenčného filtra je nechať fluorescenčné/emisné svetlo prechádzať cez zobrazovací koniec pokiaľ je to možné a zároveň úplne blokovať excitačné svetlo, aby sa dosiahol najvyšší pomer signálu k šumu.Najmä pri aplikácii multifotónového budenia a totálneho vnútorného odrazového mikroskopu spôsobí slabý šum aj veľké rušenie zobrazovacieho efektu, takže požiadavka na pomer signálu k šumu je vyššia.
2. Poznať excitačné a emisné spektrum fluorofóru.Aby sa vytvorila sada fluorescenčných filtrov, ktorá generuje vysokokvalitný, vysoko kontrastný obraz s čiernym pozadím, excitačné a emisné filtre by mali dosiahnuť vysoký prenos s minimálnym zvlnením priepustného pásma v oblastiach, ktoré zodpovedajú excitačným špičkám alebo emisiám fluorofóru.
3. Zvážte životnosť fluorescenčných filtrov.Tieto filtre musia byť nepriepustné pre intenzívne svetelné zdroje, ktoré generujú ultrafialové (UV) svetlo, ktoré by mohlo viesť k „vyhoreniu“, najmä budiaceho filtra, pretože je vystavený plnej intenzite zdroja osvetlenia.
Rôzne fluorescenčné ukážkové obrázky
Zdroje sa zhromažďujú a organizujú na internete a používajú sa iba na učenie a komunikáciu.Ak dôjde k porušeniu, kontaktujte nás, aby sme ich odstránili.
Čas odoslania: 09. december 2022